己烯雌酚类检测试剂盒使用说明书（酶联免疫法）

1 己烯雌酚类检测试剂盒原理及用途
己烯雌酚是甾类同化激素，被大量用于促进反刍动物的生长。但由于己烯雌酚存在明显的致癌性，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。我国农业部第235号文件中规定，动物源性食品中己烯雌酚的残留*为不得检出。
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测尿样、组织、饲料等样本中的己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的己烯雌酚和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗己烯雌酚抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含己烯雌酚含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中己烯雌酚的残留量。
2 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.1ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：37℃，30min～30min～15min
2.3 检测下限：
组织（虾、鱼）………………………0.2ppb
猪肉/肝、鸡肉/肝……………………2ppb
配合饲料………………………………10ppb
浓缩/预混饲料………………………20ppb
尿液……………………………………0.6ppb
2.4 交叉反应率：
己烯雌酚………………………………100%
双烯雌酚………………………………38.5%
己烷雌酚………………………………8.5%
己炔雌二醇……………………………<0.1%
雌三醇…………………………………<0.1%
 2.5 样本回收率：
尿     样   ……………………… 70%±10%
组     织   ……………………… 85%±10%
饲     料   ……………………… 90%±10%
3 试剂盒组成
酶标板……………………………96孔
标准品：各1ml
0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
酶标记物（红盖）…………………11ml
抗体工作液（蓝盖）………………5.5ml
底物液A（白盖）……………………6ml
底物液B（黑盖）……………………6ml
终止液（黄盖）………………………6ml
20X浓缩洗涤液（白盖）……………40ml
5X复溶液（黄盖）…………………50ml
说明书………………………………1份
4 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 试剂：乙腈、氢氧化钠、丙酮、浓磷酸（含量85%）
5 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
配液1：6M H3PO4 溶液
100ml 浓H3PO4（含量85%）加去离子水150ml混合均匀。
配液2：2M NaOH溶液
    8gNaOH加去离子水100ml溶解。
配液3：1M NaOH溶液
    4g NaOH加去离子水100ml溶解。
配液4：乙腈-丙酮混合液
    V乙腈：V丙酮=4:1
配液5：复溶液
    将5×复溶液用去离子水5倍稀释，用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。
5.3 样本前处理步骤：
5.3.1 组织（鸡、鸭、猪肉/猪肝、虾、鱼)样本处理方法 
1）称取2±0.05g匀浆后的样本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，振荡2min，15℃4000r/min离心10min； 
2）取3ml上清液，60℃氮气/空气吹干； 
3）加入0.5ml氯，振荡20s，加入2ml 2M NaOH，振荡30s，4000r/min离心5min； 
4）取上清液1ml，加入200µl 6M H3PO4，振荡5s； 
5）加入3ml乙腈萃取，振荡2min，室温4000r/min离心10min，取上层有机相，60℃氮气/空气吹干； 
6）用1ml样本复溶液溶解干燥的残留物，振荡混匀30s。
不同样本按如下方法稀释： 
A）虾鱼：直接取50µl水相用于检测。 
    样本稀释倍数：2    检测下限：0.2ppb
B）猪肉/肝、鸡肉/肝：取50µl水相加入450µl样本复溶液，振荡混合30s；取50µl用于检测。
    样本稀释倍数：20    检测下限：2ppb
5.3.2 饲料样本处理方法 
1）称取2±0.05g捣粹后的饲料样本，加入8ml乙腈，振荡2min，15℃ 4000r/min离心10min； 
2）取2ml上清液，60℃氮气/空气吹干； 
3）加入0.5ml氯，振荡20s，加入2ml 1M NaOH，振荡30s，4000r/min离心5min； 
4）取1ml上清液，加入100µl 6M H3PO4，振荡5s；
不同样本按如下方法稀释： 
A）配合料：取50µl，加入950µl样本复溶液，振荡混匀30s，取50µl 用于检测。
    样本稀释倍数：100    检测下限：10ppb
B)浓缩料/预混料：取25µl，加入975µl样本复溶液，振荡混匀30s，取50µl 用于检测。
    样本释倍数：200    检测下限：20ppb 
5.3.3 尿样样本处理方法 
1）取2ml尿液到离心管中，室温4000r/min离心10min，直至清亮； 
2）移取1ml清亮尿液至离心管中，加入1ml 1M NaOH强烈振荡5min； 
3）加入100µl 6M H3PO4，振荡30 s； 
4）再加入8ml氯进行萃取，振荡5min。15℃4000r/min离心10min； 
5）去掉上层的水相，取下层有机相4 ml，60℃氮气吹干； 
6）用3ml样本复溶液干燥的残留物，混合30s；
7）取50µl用于分析。 
    样本稀释倍数：6    检测下限：0.6ppb
6 酶联免疫试验步骤
    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
实验开始前，用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。
6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品应用液或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光反应30分钟。
6.3 洗    涤：将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，zui后用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，37℃避光反应30分钟。
6.5 洗    涤：同上
6.6 显    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光显色15分钟。
6.7 终    止：加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。
7 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×100%
A0
A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（索取）
8 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要*，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的*性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。
9 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。