酶联免疫试剂盒(ELISA)是生物医学研究中检测抗原或抗体的核心工具，广泛应用于疾病诊断、食品安全检测及科研实验。其结果的可靠性依赖于严格的标准化操作流程，从样本处理到较终OD值(光密度值)解读，每一步都需精准控制。以下为全流程操作指南：
一、样本处理：
样本类型多样(如血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清)，处理不当会导致目标物降解或干扰检测。关键步骤包括：
•血清/血浆分离：静脉采血后静置30分钟(促凝管)或离心(2000-3000rpm，10-15分钟，4℃)，分离血清/血浆后立即分装(避免反复冻融)，-20℃保存(长期保存需-80℃)，防止蛋白变性。
•组织/细胞样本：匀浆后离心(12000rpm，10分钟，4℃)取上清，用PBS(pH 7.4)稀释至合适浓度(参考试剂盒说明书)，避免颗粒杂质堵塞微孔板。
•避免干扰物：样本中若含叠氮钠(防腐剂)、甘油(高浓度)或脂类，需提前处理(如过滤或稀释)，防止抑制酶活性或影响显色。
二、加样与孵育：
1.加样：使用排枪或单道移液器(避免交叉污染)，将标准品、阳性对照、阴性对照及样本按顺序加入微孔板(通常为96孔，每孔100μL)，加样时枪头垂直悬空(避免触碰孔壁)，保证每孔体积一致(误差≤2%)。
2.孵育：根据试剂盒要求，室温(20-25℃)或37℃孵育(常见1-2小时)。孵育期间需避光(防止光敏反应)，并将微孔板置于湿盒中(保持湿度>80%，避免孔内液体蒸发导致浓度变化)。
三、洗涤：
洗涤是降低背景信号的关键步骤。用PBS-Tween 20(0.05%Tween 20的PBS缓冲液)作为洗涤液，通过洗板机(自动)或手动(每孔300μL，重复3-5次)清洗微孔板，每次洗涤后需拍干(用干净吸水纸轻压孔底，避免残留液体)。过度洗涤可能导致抗体脱落，洗涤不足则会增加非特异性吸附(背景值升高)。
四、显色与终止：信号生成的精准调控
1.加酶标二抗/底物：孵育后加入酶标记的二抗(如HRP标记，对应辣根过氧化物酶)或底物溶液(如TMB，四甲基联苯胺)，37℃避光孵育15-30分钟(HRP-TMB体系显色至蓝色，AP-PNPP体系显色至黄色)。
2.终止反应：加入终止液(如1M硫酸或2M盐酸，针对TMB体系)，立即终止酶促反应(溶液由蓝色变黄色，30分钟内完成读数)。
五、OD值解读：
使用酶标仪在450nm波长(参考波长630nm校正背景)读取各孔OD值，通过标准曲线(试剂盒提供的标准品浓度与OD值线性回归方程)计算样本中目标物的浓度。关键注意事项：
•空白对照校正：用不含抗原/抗体的孔(仅缓冲液)调零，消除背景干扰；
•质控验证：阳性对照OD值应在试剂盒规定范围内(如>1.0)，阴性对照OD值应低(如<0.1)，否则需重新实验；
•结果判定：样本OD值高于临界值(Cut-off值，通常为阴性对照均值+2-3倍标准差)判定为阳性，具体需结合试剂盒说明书。
标准化操作流程是酶联免疫试剂盒结果可靠性的基石，从样本处理到OD值解读的每一步严谨执行，才能为科研与临床提供准确的数据支撑。
更新时间：2025-09-23 
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