酶联免疫试剂盒(ELISA)是生物医学研究中检测抗原或抗体的核心工具,广泛应用于疾病诊断、食品安全检测及科研实验。其结果的可靠性依赖于严格的标准化操作流程,从样本处理到较终OD值(光密度值)解读,每一步都需精准控制。以下为全流程操作指南:
一、样本处理:
样本类型多样(如血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清),处理不当会导致目标物降解或干扰检测。关键步骤包括:
•血清/血浆分离:静脉采血后静置30分钟(促凝管)或离心(2000-3000rpm,10-15分钟,4℃),分离血清/血浆后立即分装(避免反复冻融),-20℃保存(长期保存需-80℃),防止蛋白变性。
•组织/细胞样本:匀浆后离心(12000rpm,10分钟,4℃)取上清,用PBS(pH 7.4)稀释至合适浓度(参考试剂盒说明书),避免颗粒杂质堵塞微孔板。
•避免干扰物:样本中若含叠氮钠(防腐剂)、甘油(高浓度)或脂类,需提前处理(如过滤或稀释),防止抑制酶活性或影响显色。
二、加样与孵育:
1.加样:使用排枪或单道移液器(避免交叉污染),将标准品、阳性对照、阴性对照及样本按顺序加入微孔板(通常为96孔,每孔100μL),加样时枪头垂直悬空(避免触碰孔壁),保证每孔体积一致(误差≤2%)。
2.孵育:根据试剂盒要求,室温(20-25℃)或37℃孵育(常见1-2小时)。孵育期间需避光(防止光敏反应),并将微孔板置于湿盒中(保持湿度>80%,避免孔内液体蒸发导致浓度变化)。
三、洗涤:
洗涤是降低背景信号的关键步骤。用PBS-Tween 20(0.05%Tween 20的PBS缓冲液)作为洗涤液,通过洗板机(自动)或手动(每孔300μL,重复3-5次)清洗微孔板,每次洗涤后需拍干(用干净吸水纸轻压孔底,避免残留液体)。过度洗涤可能导致抗体脱落,洗涤不足则会增加非特异性吸附(背景值升高)。
四、显色与终止:信号生成的精准调控
1.加酶标二抗/底物:孵育后加入酶标记的二抗(如HRP标记,对应辣根过氧化物酶)或底物溶液(如TMB,四甲基联苯胺),37℃避光孵育15-30分钟(HRP-TMB体系显色至蓝色,AP-PNPP体系显色至黄色)。
2.终止反应:加入终止液(如1M硫酸或2M盐酸,针对TMB体系),立即终止酶促反应(溶液由蓝色变黄色,30分钟内完成读数)。
五、OD值解读:
使用酶标仪在450nm波长(参考波长630nm校正背景)读取各孔OD值,通过标准曲线(试剂盒提供的标准品浓度与OD值线性回归方程)计算样本中目标物的浓度。关键注意事项:
•空白对照校正:用不含抗原/抗体的孔(仅缓冲液)调零,消除背景干扰;
•质控验证:阳性对照OD值应在试剂盒规定范围内(如>1.0),阴性对照OD值应低(如<0.1),否则需重新实验;
•结果判定:样本OD值高于临界值(Cut-off值,通常为阴性对照均值+2-3倍标准差)判定为阳性,具体需结合试剂盒说明书。
标准化操作流程是酶联免疫试剂盒结果可靠性的基石,从样本处理到OD值解读的每一步严谨执行,才能为科研与临床提供准确的数据支撑。