端粒是真核生物染色体末端的特异DNA-蛋白结构,端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列,这一序列在生物进化中有高度的保守性(人重复序列为TTAGGG)。已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合(如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失)中起重要作用。
由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的zui末端,多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短。这一现象在体内和体外都得到证实,并且可能与真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关。
这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用。与体细胞相对照,生殖细胞是永生性的,它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息。因此它必须对抗端粒缩短。这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成。
端粒酶是一种核糖核蛋白,它们用自身的RNA成份的互补序列作模板,催化TTAGGG重复序列加到染色体末端。在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达。端粒酶反应超越了细胞的增殖限制,这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。
传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性。由于需要大量的样品材料,且检验灵敏度受局限,这一方法已被端粒重复扩增法(omeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)所取代。
标准的TRAP测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物,使用放射性标记,经凝胶电泳后,通过放射自显影显示结果。
这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法:活性光密度酶联免疫测定法。这种方法具有如下特点:
安全,无需使用放射性同位素
一步反应,使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和PCR扩增可在一个试管中进行。
应用广泛,扩增后可适用于不同分析法。
灵敏,与放射性同位素TRAP测定相当。
可靠,准确、重复性好。
快速,6-8小时得到结果。