一、 原理
T淋巴细胞膜上具有异种动物红细胞的受体,可与绵羊等动物的红细胞(E)结合形成花环;B淋巴细胞膜上具有补体C3b受体,可与补体C3b致敏的酵母菌细胞(Y)形成花环;D细胞膜上具有以上两种受体,故可同时与动物红细胞、补体C3b致敏的酵母细胞形成混合花环;N细胞无以上两种受体,不形成花环。此试验可同时检测T淋巴细胞、B淋巴细胞、D细胞及N细胞,借以了解机体细胞免疫和体液免疫水平。
二、 材料和方法
(一) 材料
家兔脱纤血液,酵母多糖试剂,新鲜小鼠血清,豚鼠肝素抗凝血,灭活小牛血清,025%戊二醛,Hanks液及生理盐水,姬姆萨氏染液与瑞氏染液。
(二) 方法
1 1%家兔红细胞悬液的制备取脱纤血,用Hanks液洗3次,zui后一次用刻度尖底离心管,以2 000~2 500 r/min离心15min,弃去上清,用Hanks液配成1%(V/V)悬液,计算细胞数,调至4×108/ml备用。
2 C3b致敏酵母细胞悬液的制备取酵母多糖试剂用生理盐水洗2次,zui后一次用刻度尖离心管2 000~2 500 r/min离心10min,用生理盐水配成1%悬液,再与等量小鼠血清充分混合均匀,置37℃水浴15min,其间不断摇晃,以使其充分作用。之后用生理盐水洗1次,再用生理盐水配成1%悬液,计算细胞数,调至1×108/ml备用。
3 淋巴细胞悬液的制备
(1) 取豚鼠肝素抗凝血2ml,加等量Hanks液进行稀释,轻轻加入装有2 ml淋巴细胞分层液的试管上层,注意使之不要与分离液混合。
(2) 置水平离心机上以2000~2500 r/min离心15min,使淋巴细胞与红细胞分开。吸取淋巴细胞层,用Hanks液洗1次,弃去上清,沉淀物悬浮后计数,用Hanks液调细胞数至1×107/ml备用。
4 花环形成试验
(1) 于同一试管中加入1×107/ml的淋巴细胞悬液、灭活小牛血清、1×108/ml C3b致敏酵母细胞悬液和4×108/ml家兔红细胞悬液各2滴,充分混匀,置37℃水浴15min,取出后以500 r/min离心5min,置4℃冰箱过夜。
(2) 取出后,吸弃少许上清,用腕力轻轻悬浮后,加入025%戊二醛1小滴,再充分混匀,涂片,自然干燥,甲醇固定,再用姬姆萨氏染液与瑞氏染液分步染色:先将姬姆萨氏染液用pH值64 PBS稀释一倍,染1~2min后水洗,再加用pH值64 PBS稀释一倍的瑞氏染液,染1~2min,水洗干燥后,用油浸镜或高倍镜观察计数。
三、 结果
镜检计数,见粘附3个以上红细胞者为T淋巴细胞;粘附3个以上C3b致敏酵母细胞者为B淋巴细胞;同时粘附2个以上红细胞和2个以上C3b致敏酵母细胞者为D细胞;无细胞粘附者为N细胞或其它细胞。计数200个淋巴细胞,算出各种细胞的百分率。有资料表明:豚鼠EY混合玫瑰花环中,T细胞20%,B细胞8%,D细胞1%,其它细胞为62%。
四、 注意事项
1 酵母多糖(zymosan)是从酵母细胞中提取的一种脂多糖,在体外能激活血清补体的旁路途径,并与裂解的补体C3b结合形成酵母多糖补体复合物。应用的小鼠血清为多个体的血清混合物,并要求血清新鲜。
2 本试验条件要求固定,被检淋巴细胞、C3b致敏酵母细胞、红细胞的比例,控制在1∶10∶40水平上。比例过大或过小,形成花环率都不准。这可能与淋巴细胞表面受体的数量有关。
3 在不吸附任何细胞的其它细胞中,除N细胞外,可能还包括幼稚型的T、B淋巴细胞和其它没有红细胞和C3b受体的细胞以及没有粘附的T、B淋巴细胞。
4 加入戊二醛主要是起偶联作用,过多会使玫瑰花环率升高,加入时要控制用量。戊二醛用pH值64 PBS稀释。