一、 原理
T淋巴细胞膜上具有异种动物红细胞的受体，可与绵羊等动物的红细胞(E)结合形成花环；B淋巴细胞膜上具有补体C3b受体，可与补体C3b致敏的酵母菌细胞(Y)形成花环；D细胞膜上具有以上两种受体，故可同时与动物红细胞、补体C3b致敏的酵母细胞形成混合花环；N细胞无以上两种受体，不形成花环。此试验可同时检测T淋巴细胞、B淋巴细胞、D细胞及N细胞，借以了解机体细胞免疫和体液免疫水平。

二、 材料和方法
(一) 材料
家兔脱纤血液，酵母多糖试剂，新鲜小鼠血清，豚鼠肝素抗凝血，灭活小牛血清，025%戊二醛，Hanks液及生理盐水，姬姆萨氏染液与瑞氏染液。

(二) 方法
1 1%家兔红细胞悬液的制备取脱纤血，用Hanks液洗3次，zui后一次用刻度尖底离心管，以2 000～2 500 r/min离心15min，弃去上清，用Hanks液配成1%(V/V)悬液，计算细胞数，调至4×108/ml备用。
2 C3b致敏酵母细胞悬液的制备取酵母多糖试剂用生理盐水洗2次，zui后一次用刻度尖离心管2 000～2 500 r/min离心10min，用生理盐水配成1%悬液，再与等量小鼠血清充分混合均匀，置37℃水浴15min，其间不断摇晃，以使其充分作用。之后用生理盐水洗1次，再用生理盐水配成1%悬液，计算细胞数，调至1×108/ml备用。
3 淋巴细胞悬液的制备
(1) 取豚鼠肝素抗凝血2ml，加等量Hanks液进行稀释，轻轻加入装有2 ml淋巴细胞分层液的试管上层，注意使之不要与分离液混合。
(2) 置水平离心机上以2000～2500 r/min离心15min，使淋巴细胞与红细胞分开。吸取淋巴细胞层，用Hanks液洗1次，弃去上清，沉淀物悬浮后计数，用Hanks液调细胞数至1×107/ml备用。
4 花环形成试验
(1) 于同一试管中加入1×107/ml的淋巴细胞悬液、灭活小牛血清、1×108/ml C3b致敏酵母细胞悬液和4×108/ml家兔红细胞悬液各2滴，充分混匀，置37℃水浴15min，取出后以500 r/min离心5min，置4℃冰箱过夜。
(2) 取出后，吸弃少许上清，用腕力轻轻悬浮后，加入025%戊二醛1小滴，再充分混匀，涂片，自然干燥，甲醇固定，再用姬姆萨氏染液与瑞氏染液分步染色：先将姬姆萨氏染液用pH值64 PBS稀释一倍，染1～2min后水洗，再加用pH值64 PBS稀释一倍的瑞氏染液，染1～2min，水洗干燥后，用油浸镜或高倍镜观察计数。

三、 结果
镜检计数，见粘附3个以上红细胞者为T淋巴细胞；粘附3个以上C3b致敏酵母细胞者为B淋巴细胞；同时粘附2个以上红细胞和2个以上C3b致敏酵母细胞者为D细胞；无细胞粘附者为N细胞或其它细胞。计数200个淋巴细胞，算出各种细胞的百分率。有资料表明：豚鼠EY混合玫瑰花环中，T细胞20%，B细胞8%，D细胞1%，其它细胞为62%。

四、 注意事项
1 酵母多糖(zymosan)是从酵母细胞中提取的一种脂多糖，在体外能激活血清补体的旁路途径，并与裂解的补体C3b结合形成酵母多糖补体复合物。应用的小鼠血清为多个体的血清混合物，并要求血清新鲜。
2 本试验条件要求固定，被检淋巴细胞、C3b致敏酵母细胞、红细胞的比例，控制在1∶10∶40水平上。比例过大或过小，形成花环率都不准。这可能与淋巴细胞表面受体的数量有关。
3 在不吸附任何细胞的其它细胞中，除N细胞外，可能还包括幼稚型的T、B淋巴细胞和其它没有红细胞和C3b受体的细胞以及没有粘附的T、B淋巴细胞。
4 加入戊二醛主要是起偶联作用，过多会使玫瑰花环率升高，加入时要控制用量。戊二醛用pH值64 PBS稀释。