在ELISA试剂盒中通常有3次加样步聚，即加标本，加酶物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA试剂盒板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行溅起，不行发作气泡。加标本通常用微量加样器，按规则的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以发作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加样。
有此测定(如间接法ELISA)需用稀的血清，可在试管中按规则的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其参加血清标本，然后在微型震动器上震动1分钟以保证混和。加酶物使用液和底物用液时可用定量多道加液器，使加液进程迅速完结。在双抗体夹心法测定抗原时，如使用对于抗原分子上两个不一样抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。
ELISA试剂盒则在测守时可使标本的参加和酶标抗体的参加两步并作一步。这种双位点一步不光简化了操作，缩短了反应时间，如使用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也明显进步。单克隆抗体的使用使测定抗原的ELISA试剂盒进步到新水平。