免疫标记技术是将一些既易ELISA试剂盒测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的ELISA试剂盒免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。

1.原理

辣根过氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一种过氧化物酶，早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离此酶，以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料，经过水的抽提，硫酸铵和丙酮分级分离，再经锌离子纯化，透析除盐，冰冻干燥，便可得到高纯度的辣根过氧化物酶。

辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质，HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，Mr在40000左右，等电点7.2。溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。酶催化的zui适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸铵溶液。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，ELISA试剂盒而0.62饱和度以上则不溶。该酶zui适pH7.0(对愈创木酚为氢给体而言)。在室温下，HRP几周内稳定，加热到63℃，在15min内稳定。氧化还原电势很低，pH6.08时，E 0 =-0.2070V，pH为7.71时，E′0 =-0.2787V。HRP的辅基和酶蛋白zui大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。ELISA试剂盒酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中zui常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，ELISA试剂盒简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、ELISA试剂盒不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

酶制剂及其底物

凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶，原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求：

(1)来源方便，易于纯化;

(2)比活性高，性质稳定;

(3)ELISA试剂盒酶活性和量能

用简单方法测定。ELISA试剂盒目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP)，其次还有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。

由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以zui常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，ELISA试剂盒它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为PH3～9,酶催化的zui适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。ELISA试剂盒HRP的辅基和酶蛋白zui大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(zui高可达3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，ELISA试剂盒纯度并不表示酶活性，如当酶变性后，RZ值仍可不变。