◎ELISA实验的结果受操作影响很大，每个步骤包括加样，温育，洗涤，显色，酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥ELISA的高灵敏，强特异的优点。
◎因此,应建立实验项目的标准操作程序（SOP）。

加样
◎加样应用微量移液器（加样枪）按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
◎每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。
◎样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，特别注意加样后要在微量振荡器上振荡30秒钟，同时注意防止液体溢出。如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。
◎如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去*滴有气泡的试剂后加样。

温育
◎抗原抗体反应需要在一定温度下（37°C），经过一定的时间才能达到反应的平衡点
◎ELISA边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能 使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠加放置。
◎边缘效应（2ng/mlHBsAg一步法三种不同温育法的结果）
洗涤
◎ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。
◎手工洗涤一般采用浸泡方法：1）甩去孔内反应液；
2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；
3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；
4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。
重复以上操作至少5次。注意各种ELISA试剂盒的洗涤液尽量不要混用。
◎洗板机洗板一定要预先把板架放平，使洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干，同时要设置一定的浸泡时间。如出现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗2次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管道，避免堵孔。

显色
◎HRP催化底物的一步呈色反应，同样需要一定的时间和温度，
◎ 一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37°C，10-15分钟）恒定反应后终止
◎或根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间.

酶标仪判读结果
◎显色反应终止后应立刻比色（30分钟内）。
常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者zui为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；
TMB终止后显，测定波长为450nm，
二种底物的校正波长均用630nm。
使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。

报告方式
◎定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方式报告，S为标本A值，C.O即Cut Off值（阳性判定值）
◎夹心法和间接法以S/C.O≥1为阳性；
竟争法与中和法以S/C.O﹤1为阳性
◎Cut Off的计算公式以ELISA试剂盒说明书的为准常见的有：
◎A） C.O=2.1×N（当N不足0.05时按0.05计），
◎此公式由P/N>2.1换算而来，常用于夹心法。
◎B） C.O=0.5×N，从抑止率公式换算而来，
◎常用于竟争，中和法
◎C） C.O=N+C（C为常数），用于间接法。
◎D） C.O=C×P+N（C为常数），用于间接法。此公式zui客观，但对生产厂家要求很高，阴阳性对照测定值要基本恒定。

定量分析 用已知量的标准品作一系列稀释，ELISA测定，绘制标准曲线，结果以量或单位表示。
ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。
◎现有的ELISA定量试剂盒标准曲线只有在较窄的浓度范围内成直线，要得到的结果实属不易。
因此严禁用定性试剂盒做定量分析。

灰区概念
把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。
灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。
灰区的设置有二种：
1）C.O×（1±CV），
CV为该试剂的批内CV （一般在15-20%间）；
2）C.O±2s，s为实验室做室内质控ROC的s。

高值钩镰效应（HD-HOOK）
◎在二位点夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974） 根据此现象写实性地称之为"HD-HOOK"效应。产生该现象的分子机理有"分子变构说"和"浓度效应"等推论。
◎一步法和二步法均存在， 只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。