在我们培养 细胞系的过程中,对细胞系进行传代是一项常规的操作,传代可以帮助我们扩大 细胞系培养的数量,同时也避免了因 细胞系进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。今天我们简单讲讲传代操作(主要针对贴壁细胞系)。
实验原理:
当培养的 细胞系增殖达到一定密度后,将会出现密度抑制现象,表现为 细胞系的生长和分裂速度逐渐减慢,甚至停止。贴壁 细胞系会在培养瓶中长成致密单层 (悬浮 细胞系会充满整个体积的培养液),铺满培养瓶底部,此时如果不及时进行分装再培养,即传代培养, 细胞系将逐渐走向衰老、死亡,将培养的 细胞系从一个容器以适当比率转移到其他容器中扩大培养,称为传代培养。
首先,我们需要准备好相应的实验器材:装有75%医用消毒酒精的酒精喷壶、PBS缓冲液、含血清培养基、巴氏吸管、移液器、离心管、废液缸。至于其他的超净台、培养箱、离心机等都是一个 细胞系间的基础设施。
然后,我们需要把我们准备的器材放入超净台,打开紫外照射灭菌,值得注意的是若是培养的 细胞系对温度比较敏感,可以将含血清的培养基瓶子(包括盛放的瓶子)放入37℃的水浴箱使得培养基温度在37℃,再转移到超净台紫外灭菌,当然一般的 细胞系对培养基的温度不是很敏感,不用对培养基加温也是可以的。另外, 细胞系培养间也需要紫外照射半小时左右。
操作步骤:
1、紫外照射灭菌后,我们应该穿好灭菌服,戴好灭菌手套和口罩。
2、从培养箱取出 细胞系培养瓶(一般选择处于对数期的 细胞系),用酒精喷壶在培养瓶表面喷洒75%酒精消毒,转移培养瓶到超净台。
3、打开盖子,轻轻吸出旧的培养液,用巴氏吸管加入适量PBS缓冲液洗涤1-2次(注意从侧壁加入,以免冲掉 细胞系),弃去PBS缓冲液。
4、可用移液器加入1-2ml(具体量根据实验需要确定,此处仅为参考用量),“十字"晃动,使充分接触 细胞系。
5、将加入的 细胞系培养瓶转移到倒置显微镜载物台,镜下观察 细胞系消化情况,当 细胞系变圆且大量脱落时,准备终止消化,用75%的酒精喷洒培养瓶表面,转移到超净台。
6、用移液器(或巴氏吸管)加入等量含血清培养基,终止消化。移液器(或巴氏吸管)充分吹打(动作也不要太猛,毕竟 细胞系也是蛮脆弱的),使 细胞系能够脱落。
7、将培养瓶中混合液体转移至离心管中(离心管规格根据实验需要确定),配平,离心5分钟左右(离心机转速根据 细胞系种类而定,常见的有1000rpm/min)
8、离心好后,用酒精喷壶喷洒离心管表面,转移进超净台,打开盖子,将上清液倒入废液缸。
9、加入适量体积含血清培养基,用移液器或巴氏吸管轻轻吹打,制成 细胞系悬液。
10、将 细胞系悬液分装进2个(或多个)洁净灭菌培养瓶,加入适量培养基,盖好盖子
1、将分装好的培养瓶置于倒置显微镜载物台,观察 细胞系情况, 细胞系应保证一定数量,数量太少会影响生长情况。
12、在培养瓶上做标记,注明传代时间, 细胞系种类,操作人员等信息。在放入培养箱之前应再次用酒精喷一喷培养瓶表面,然后应记得整理操作台,用75%酒精擦拭超净台台面,清理废液和垃圾。
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